Генетическая экспертиза митохондриальной ДНК (мтДНК)

Генетическая информация определяет рост, развитие, строение, обмен веществ, психологический склад человека, а также предрасположенность к различным заболеваниям. Эта информация зашифрована в ДНК, которая представлена не только в ядре клетки, но и в органеллах (митохондриях), необходимых для превращения химической энергии из пищи в формы, необходимые клетке – это так называемая митохондриальная ДНК.

Митохондрии – это "энергетические станции" клетки, без которых она не сможет существовать. Митохондрии имеют собственную генетическую информацию, зашифрованную в митохондриальной ДНК. Когда-то митохондрии представляли собой бактерии. Но, попав в эукариотические клетки, они растеряли часть своей генетической информации, часть отдали в ядро клетки-хозяина, и сейчас митохондриальная ДНК состоит всего лишь из 37 генов, необходимых для окисления глюкозы до углекислого газа и воды и синтеза клеточного "топлива": АТФ (аденозинтрифосфат) и НАДН (восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида).

Митохондриальная ДНК передается от матери ко всем ее детям, от дочерей к внукам. Почему же так происходит? Почему мы не можем унаследовать митохондриальную ДНК от отца?

Яйцеклетки (женские половые клетки) содержат огромное количество митохондрий, в сотни, а то и в тысячи раз больше, чем содержат сперматозоиды (мужские половые клетки), которым митохондрии необходимы в основном только для движения. При оплодотворении сперматозоид проникает в яйцеклетку, зачастую теряя свой жгутик и митохондрии, которые находятся в основании жгутика. Затем сперматозоид сливается с яйцеклеткой, происходит образование зиготы. Митохондрии сперматозоида, меченные убиквитинином, разрушаются ооцитом, и ядро сперматозоида сливается с ядром яйцеклетки, давая начало новой жизни.

Митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии. И мужчины, и женщины получают митохондрии из цитоплазмы материнской яйцеклетки. Эти маленькие двуспиральные цепочки ДНК тянутся к нам из далекого прошлого, со времен проматери "митохондриальной Евы", которая являлась общим предком всех ныне живущих людей по материнской линии. Если ядерную ДНК, которая представлена 46-ю хромосомами, ребенок наследует от обоих родителей (половину – 23 – от матери, половину от отца), то митохондрии и мтДНК ребенок получает только от матери. Именно поэтому митохондриальная ДНК является идеальным объектом для генетической экспертизы родственных связей по материнской линии. Но если в случае установления отцовства используются полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ), то генетическая экспертиза митохондриальной ДНК представляет собой выявление индивидуальных точковых нуклеотидных изменений в ДНК митохондрий, их отождествление или дифференцировку. В митохондриальной ДНК гены очень плотно "упакованы". Несмотря на то что в мтДНК очень мало тандемных повторов, она буквально "напичкана" точковыми мутациями, что делает ее весьма вариабельной. Именно эти мутации детектируют и анализируют с помощью секвенаторов нового поколения при исследовании митохондриальной ДНК.

Митохондриальная ДНК обладает рядом особенностей, которые отличают ее от ядерной ДНК и позволяют использовать при генетической экспертизе:

• мтДНК не подвержена рекомбинации, поэтому вся молекула изменяется только путем мутирования на протяжении тысячелетий;
• данный тип ДНК наследуется только по материнской линии;
• мтДНК можно выделить из любого биологического материала;
• благодаря большому количеству копий мтДНК иногда может быть единственным источником ДНК - например, при сильно деградированной ядерной ДНК или недостаточности биологического материала;
• высокий мутационный уровень мтДНК, по сравнению с одной копией ядерной ДНК, увеличивает идентификационный уровень генетической экспертизы.

В каких случаях необходимо проведение генетической экспертизы митохондриальной ДНК (МТДНК)?

• для установления схожести между двумя женщинами или женщиной и мужчиной у предполагаемых родственников по материнской линии. Например, дедушка/бабушка-внук, дядя/тетя-племянник, брат-сестра;
• при исследовании крайне малого количества биологического материала. Количество копий мтДНК в одной клетке составляет 100-10 000, в то время как в ядерной ДНК всего лишь по две пары каждой из 23 хромосом;
• при анализе образцов десятилетней, столетней и даже тысячелетней давности. Например, по мтДНК удалось определить останки членов российской императорской семьи Романовых.
• в случае отсутствия другого генетического материала. Например, при наличии всего лишь одного волоса. Ствол (стержень) волоса содержит небольшое количество ядерной ДНК, но является отличным источником митохондриальной ДНК;
• для определения принадлежности генетического профиля конкретной генеалогической линии человечества (европейской гаплогруппе, африканской, ближневосточной, американской и т.д.). Это позволяет установить происхождение человека.

Какие материалы необходимо предоставить для проведения генетической экспертизы митохонриальной ДНК (МТДНК)?

Митохондриальная ДНК присутствует в каждой клетке организма, включая те, где нет ядра (например, тромбоциты, эритроциты, клетки волосового стержня и другие). Поэтому для анализа мтДНК годятся все ткани организма: кости, зубы, кровь, сперма, остатки скелетированных тел и другие. Как правило, для проведения генетической экспертизы, например, для установления отцовства или материнства, берут образцы буккального эпителия (соскобы из щеки), кровь с пальца (0,3-0,5 мл), кровь на ватном диске, волосы или ногти. Взятие образцов тканей должно осуществляться в соответствии с законодательством, включая Федеральный закон "О государственной судебно-экспертной деятельности в Российской Федерации" и приказ Минздравсоцразвития РФ о порядке проведения судебно-медицинских экспертиз.

Полученные биологические образцы направляются экспертами-генетиками в специализированную лабораторию, где проводится трехэтапное исследование: 1) извлечение мтДНК; 2) амплификация (умножение) конкретного участка мтДНК; 3) определение первичной последовательности нуклеотидов этого участка.

На первом этапе эксперты извлекают ДНК из исходного материала. Процесс извлечения митохондриальной ДНК из клеток довольно сложный и может занимать до 24 часов. Например, извлечение мтДНК из крови занимает около двух часов, а лизирование (разрушение) ткани волос или ногтей может потребовать обработки специальными ферментами до 12 часов. В преимущественно используются коммерческие реактивы от ведущих зарубежных производителей, таких как Applied Biosystems, Promega, QIAGEN.

На втором этапе проводится полимеразная цепная реакция (ПЦР), в ходе которой участок мтДНК (D-петли) многократно увеличивается. Анализ нуклеотидной последовательности D-петли является ключевым при исследовании мтДНК, поскольку вариабельность D-петли позволяет различать индивидуальные особенности. Каждый человек имеет свой индивидуальный участок D-петли, унаследованный по материнской линии, так как варианты этого участка могут различаться из-за мутаций. D-петля обладает уникальными свойствами, что делает ее специфичной для каждого индивидума.

На последующем этапе выполняют очищение увеличенного фрагмента митохондриальной ДНК и его секвенирование. Секвенирование представляет собой определение первичной последовательности ДНК, другими словами - расшифровку генетического кода, который уникален для каждого организма. Путем сопоставления нуклеотидных последовательностей D-петли из различных образцов эксперт определяет их соответствие друг другу и сравнивает их с референтной последовательностью мтДНК. Вычисление несовпадений нуклеотидов (мутаций) ДНК осуществляется в соответствии с статьей 3.6 Методических указаний Минздрава РФ №2001/4 от 25.01.2001 года "Применение молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установлении биологического родства". При приведении заключений генетической экспертизы митохондриальной ДНК указывается вероятность совпадения признаков, выраженная в процентах.

Все результаты тестирования мтДНК сопоставляют с так называемой "стандартной кембриджской последовательностью". Это первая нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК, которая была расшифрована. Это исследование было проведено в 1981 году в Кембридже Стеном Андерсеном, поэтому последовательность мтДНК также известна как "последовательность Андерсена" (в англоязычной литературе). Поскольку это первая последовательность митохондриальной ДНК, она стала международным стандартом. В настоящее время все мутации в анализируемой последовательности отсчитывают от этой стандартной. Путем сравнения нуклеотидной последовательности исследуемой мтДНК со стандартной кембриджской последовательностью устанавливают генетический профиль исследуемой мтДНК, тем самым определяя ее индивидуальную генетическую характеристику.

Исходя из генетического профиля, эксперты определяют, к какой расе или гаплогруппе относится изучаемая митохондриальная ДНК (и, соответственно, к какому человеку она принадлежит). Таким образом, генетическая экспертиза митохондриальной ДНК может быть использована для создания ДНК-генеалогии и в некоторых случаях для предположения внешности искомого человека. В то время как по Y-хромосоме ученые стремятся найти предполагаемого Адама, по генетическому профилю мтДНК можно определить предполагаемую Еву.

задачи Генетической экспертизы митохондриальной ДНК

• Существуют ли совпадения нуклеотидных последовательностей мтДНК у анализируемых биологических образцов? Для этого в соответствии с определенными правилами сравнивают полученные индивидуальные профили полиморфизма анализируемых фрагментов ДНК с целью их опознавания или выявления сходств и различий, а также для установления определенных фактов, имеющих доказательственное значение по делу.
• Если установлено совпадение признаков, то какова вероятность того, что это совпадение является обоснованным, а не случайным?

Нормативно-правовая база для проведения генетической экспертизы митохондриальной ДНК

• Федеральный закон от 31 мая 2001 года № 73-ФЗ "О государственной судебно-экспертной деятельности в Российской Федерации";
• Приказ Минздравсоцразвития РФ № 346н от 12.05.2010 года "Об утверждении Порядка организации и проведения судебно-медицинских экспертиз";
• Методические указания Минздрава РФ № 2001/4 от 25.01.2001 года "Применение молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления биологического родства";
• Семейный кодекс РФ. Глава 10 "Установление происхождения детей".