Генетическая экспертиза по определению видовой принадлежности биологических объектов (животных и растений)

В настоящее время для того, чтобы установить видовую принадлежность того или иного биологического объекта, требуется привлечение различных специалистов: например, для определения птиц необходимы услуги орнитологов, насекомых – энтомологов, растений – ботаников, грибов – микологов, рыб – ихтиологов, червей - гельминтологов и т.д. В ряде случаев требуются специалисты с узкой специализацией: например, энтомологи делятся на апиологов (изучают пчел), диптериологов (занимаются изучением двукрылых насекомых), гименоптериологов (изучают перепончатокрылых насекомых), мирмекологов (занимаются муравьями) и т.д. Часто поиск таких узконаправленных специалистов представляется сложной задачей, особенно в организациях занимающихся судебной экспертизой. Кроме того, иногда требуется установить биологическую принадлежность, имея лишь часть организма, а не весь. Стандартные методы идентификации, такие как использование определителей, в этом случае неэффективны, поскольку с небольшими частями некогда живого организма определить вид невозможно.

В связи с этим, а также для упрощения и ускорения идентификации биологических объектов, в 2004 году был запущен международный проект штрихкодирования жизни (International Barcode of Life - iBOL). Целью проекта iBOL является создание базы данных (ДНК-библиотеки штрихкодов) для максимально возможного числа видов живых существ. Каждому виду назначается штрихкод, содержащий информацию о виде, месте обитания, численности и прочее. ДНК-штрихкод устанавливается по последовательности нуклеотидов конкретного гена, отличающегося у всех живых организмов. Баркодирование ДНК позволяет однозначно идентифицировать каждый вид живых организмов по небольшому фрагменту генома.

На данный момент ДНК-штрихкодированию подверглись 126 731 вид животных, 42 129 видов растений и 2 448 видов грибов и других организмов. Количество нуклеотидных последовательностей ДНК-баркодов в международной базе данных достигло двух миллионов.

Генетическая экспертиза для определения видовой принадлежности биологических объектов – это современный вид генетической экспертизы, который направлен на определение видов различных живых объектов, основанный на анализе ДНК-штрихкода и использующий для этого образцы биологического происхождения.

Преимущества генетической экспертизы по определению видовой принадлежности биологических объектов перед традиционными методами идентификации видов:

• не требует поиска и привлечения различных специалистов по биологии;
• обеспечивает точное определение видов живых организмов. Например, различия между гусеницами могут быть незаметными, но генетический анализ показывает, что они относятся к разным видам;
• не требует больших объемов биологического материала: для идентификации вида птицы стандартными орнитологическими методами (по определителю) необходимо целое тело птицы, в то время как для баркодирования ДНК достаточно маленького образца ткани птицы.

В каких случаях необходимо проведение генетической экспертизы по определению видовой принадлежности биологических объектов?

• определение видов живых организмов в случаях различных судебных дел;
• установление видов живых объектов по их следам в следственных действиях;
• ДНК-баркодирование полезно при определении вида заболевания, которое вызвали грибы, для быстрой и точной диагностики и лечения;
• при подмене продукции: мошенничество в рыбной торговле, фальсификация лекарств и другие случаи;
• в сельском хозяйстве определение видов необходимо для определения вредных насекомых, а также для выбора посевного материала.

ДНК-баркодирование – это метод для решения проблем, связанных не только с судебными делами, но и с повседневной жизнью. Генетическая экспертиза по определению видовой принадлежности биологических объектов поможет определить вид подаренных попугаев, цветов, различать красиво цветущие растения у бабушки на подоконнике, поможет определить биологическое происхождение экзотического мяса, решить спор о собранных в лесу грибах, сделать оригинальный подарок, подарив растение с генетическим паспортом, и многое другое. Штрихкод ДНК позволяет быстро идентифицировать любой объект биологического происхождения и определить его видовую принадлежность.

Для проведения генетической экспертизы по определению видовой принадлежности биологических объектов достаточно предоставить любой биоматериал. Для более эффективного выделения ДНК предпочтительнее использовать мягкие ткани живых организмов. Объем биоматериала не должен быть менее 0,5 см³.

Генетическое исследование биологического материала проходит через четыре этапа:

1. Извлечение ДНК из биологического материала. Процесс извлечения ДНК из клеток считается ключевым этапом исследования, определяющим последующие шаги. Обычно для этих целей применяются коммерческие наборы реактивов от ведущих иностранных производителей, таких как Applied Biosystems (США), Promega (США), QIAGEN (Германия).
2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР). При выполнении ПЦР происходит несколько кратное увеличение (копирование) целевого участка ДНК. Этот участок ДНК представляет собой генетический маркер, последовательность нуклеотидов которого отличается у различных видов живых существ. В ходе генетической экспертизы на идентификацию видов биологических объектов анализируются следующие гены:

• Идентификация животных осуществляется по нуклеотидной последовательности гена субъединицы 1 цитохром C оксидазы (COI). Ген COI закодирован митохондриальной ДНК (мтДНК). Исследование молекулы мтДНК имеет несколько преимуществ по сравнению с изучением ядерной ДНК: так, ее можно извлечь из любых тканей организма; количество молекул мтДНК в одной клетке достигает сотен, в то время как ядерная ДНК имеет только одну копию; мтДНК можно получить из объектов, возраст которых составляет сотни лет.
• Определение видов растений выполняется по нуклеотидной последовательности генов рибулозобисфосфаткарбоксилазы (rbcL) и матуразы К (matK). Эти гены кодируются молекулами ДНК хлоропластов – зеленых пластид, содержащих хлорофилл, который обеспечивает фотосинтез. Один хлоропласт способен содержать до ста копий молекул ДНК, что делает ДНК хлоропластов удобным объектом генетической экспертизы (также как и митохондриальную ДНК);
• Определение видов грибов осуществляется по нуклеотидной последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера ядерной рибосомальной РНК (internal transcribed spacers - ITS). Регион ITS является, во-первых, высоковариабельным между видами грибов. Во-вторых, это высококопийный участок генома, что облегчает штрихкодирование грибов.

3. Определение первичной последовательности (секвенирование) ДНК. Полученный в ходе ПЦР-реакции фрагмент ДНК (маркерный ген) подвергается секвенированию с использованием модифицированного метода Сенгера. В результате экспертизы ДНК выявляется нуклеотидная последовательность цепи ДНК, которая является "ключом" для определения вида живого организма.
4. Биоинформационный анализ. Полученная в процессе секвенирования нуклеотидная последовательность ДНК сравнивается с различными нуклеотидными последовательностями ДНК, хранящимися в международных базах данных. Если нуклеотидная последовательность известного биологического вида полностью совпадает с анализируемой нуклеотидной последовательностью, это свидетельствует об однозначном биологическом происхождении и, следовательно, позволяет определить вид живого организма.